耐除草剂基因aroAA1501可拆分位点的鉴定

基因拆分技术(gene splitting)能有效避免转基因作物中目标性状向环境中的逃逸.为了利用基因拆分技术培育新型耐草甘膦(glyphosate)的转aroAA1501基因水稻(Oryza sativa),本研究依据aroAA1501蛋白的高级结构筛选出13个可能的拆分位点,PCR的方法将aroAA1501拆分成N端(An)和C端(Ac)2部分,并分别与Ssp DnaE intein的N端(In)和C端(Ic)结合形成融合基因An-In和Ic-Ac.以pETDuet-1为基础载体,构建了单独含有An-In、Ic-Ac和同时含有An-In/Ic-Ac的原核表达载体共40个.将构建好的原核表达载体导入营养缺陷型大肠杆菌(Escherichia coli)菌株ER2799中,通过功能互补试验证明aroAA1501在140/141、224/225和230/231位点处拆分后,拆分开的蛋白在蛋白内含肽intein介导下重新组装成有功能的完整蛋白.草甘膦耐受性试验证明230/231是最适宜的拆分位点,拆分后重新组装的蛋白对草甘膦的耐受性是完整aroAA1501蛋白的3倍.对含有aroAA1501、224N-In/Ic-225C、230N-In/Ic-231C和140N-In/Ic-141C的ER2799菌株中外源基因以及表达的重组蛋白分别进行qRT-PCR以及ELISA酶活分析,结果表明基因拆分后重组菌株的抗性差异是由于蛋白水平差异造成的而不是转录水平的差异造成的.此研究为后期培育耐草甘膦的转aroAA1501基因水稻提供了基础资料.