甘薯茎腐病菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

达旦提狄克氏菌(Dickeya dadantii)引起的甘薯(Ipomoea batatas)茎腐病是严重危害甘薯的一种病害.目前该病在浙江、河北、河南等省均有发生.带菌种薯和种苗的远距离调运是病害向无病区传播的主要途径,因此准确、灵敏、快速的检测方法是严格执行检疫措施的有力工具.将D.dadantii编码鞭毛蛋白基因(flagellin protein gene,fliC)序列与近缘种比对发现,该基因特异性强,适合作为分子检测的靶标.本研究以fliC基因为靶标,设计了特异性引物和TaqMan探针,建立了D.dadantii荧光定量PCR (TaqManqRT-PCR)检测方法.结果发现,该方法对D.dadantii显示了良好的特异性,能使其与同属不同种及不同属细菌有效区分.同时研究表明,该方法具有较高的灵敏度,对菌体DNA的检测灵敏度可达280 fg/μL,是常规PCR的1 000倍;对菌液的检测灵敏度可达2 CFU/μL (CFU:菌落形成单位,colony forming units),比常规PCR检测方法高100倍.利用NGM (nematode growth medium)培养基对疑似甘薯茎腐病样本进行分离,发现D.dadantii能够在培养基上形成深褐色至蓝色的菌落,可明显提高病原菌分离纯化的效率.采用构建的TaqMan qRT-PCR方法、常规PCR法和基于NGM培养基的分离培养法对70份甘薯和土壤样品进行实际样本的检测;结果表明,TaqMan qRT-PCR法、常规PCR法和分离培养法的阳性检出率分别为91.4％、77.1％和71.4％,TaqMan qRT-PCR检测准确性更高,且将检测时间从96 h缩短为1.5 h.本研究建立的基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测体系能有效用于甘薯茎腐病疑似样本的快速检测,对该病害的检疫具有重要的意义.