鸡HNF4α蛋白的原核表达、纯化及特异性抗体制备

肝细胞核因子4α (hepatocyte nuclear factor 4α,HNF4α)是核受体超家族成员之一,广泛地调控葡萄糖、胆固醇及脂肪酸代谢途径中多种基因的表达.为了获得鸡(Gallus gallus) HNF4α特异性抗体,本研究首先根据大肠杆菌(Escherichia coli)的密码子偏好性,优化并合成鸡HNF4α基因,构建原核重组表达载体pET-30a(+)-HNF4α.其次,将该重组表达载体转化至E.coli BL21 (DE3)进行诱导表达,并对诱导温度和异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)浓度进行优化,表达产物利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl dulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)进行鉴定.最后,将HNF4α重组蛋白经Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化后免疫新西兰大白兔(Oryctolagus cuniculus),制备抗鸡HNF4α的特异性抗体.利用间接酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测抗体效价,并用所得抗体进一步分析HNF4α在鸡各组织的表达情况.结果 表明,经密码子优化后构建的原核重组表达载体pET-30a(+)-HNF4α可在E.coli BL21 (DE3)中高效表达,在37℃、0.5 mmol/L IPTG、诱导4h的条件下,在上清液中有较多可溶性蛋白表达.利用SDS-PAGE检测发现,通过Ni-NTA琼脂糖凝胶纯化获得了大小约为51.6 kD的融合蛋白且纯度达90％以上;ELISA检测抗体效价可达1∶512 000.利用该抗体分析鸡各组织蛋白表达谱发现,HNF4α在肝脏和肾脏中高表达,在小肠、睾丸中少量表达,而在其他组织几乎不表达.综上所述,本研究成功制备了效价高、特异性强的鸡HNF4αt抗体,为进一步研究鸡HNF4α基因功能提供了基础资料.