内含子介导的TBSV病毒表达载体的构建和功能分析

重组植物RNA病毒对寄主的侵染力下降是影响植物RNA病毒表达载体效率的一个限制因素.为了探索提高病毒载体表达效率的途径,在番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus,TBSV)表达载体DTBSV-G的基础上,于病毒编码的两个关键基因编码区内插入不同数量拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组内含子序列,构建了内含子数目和位置不同的系列病毒表达载体.接种寄主植物Nicotiana excelsiana后,通过比较分析病毒携带的绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,gfp)在寄主植物叶片中的表达情况,对在病毒基因组编码区内引入内含子的有效性和规律性进行了探索.结果显示,NetPlantGene软件可以准确地识别出插入病毒序列中的全部内含子序列,表明利用该软件对内含子剪接情况进行提前预判的方法具有一定的实用价值.反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)检测结果显示,对照组的扩增产物片段均大于实验组且条带大小与理论预期一致;Western blots实验能够检测到完整的P19、P33和P92目的蛋白表达产物.RT-PCR和Westem blots实验结果表明,病毒载体中内含子在寄主植物细胞核中确实能够被正确的识别和剪接.GFP在接种叶片上的表型和蛋白质水平定性与定量实验结果显示,插入2个内含子和11个内含子可以使病毒表达载体的表达效率提高约2倍,而插入9个内含子对病毒表达载体效率无明显的增效作用.由此推测,增效作用与内含子数量无关,内含子的插入位置可能发挥着关键的作用.研究结果将为内含子在植物病毒RNA表达载体中的应用奠定一定的理论和实践基础.