烟草NteIF2α的原核表达、纯化及多克隆抗体制备和应用

真核翻译起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α,eIF2α)在真核生物的蛋白合成调控中起重要作用.为了研究eIF2α的功能及其参与的烟草(icotiana tabac um)蛋白翻译调控机制,本研究首先构建了原核表达载体pET15b-NteIF2α,并使用0.2和0.5 mmol/L异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)诱导4h,在大肠杆菌(Escherichia coli)表达菌BL21-CodonPlus-(DE3)-RIPL中成功表达了烟草K326的NteIF2α蛋白,并采用Western blot对表达的蛋白进行了鉴定.其次,对NteIF2α的原核表达条件进行优化,结果表明,在16℃、0.2 mmol/L IPTG诱导13h,在大肠杆菌上清中获得了可溶性的NteIF2α蛋白.采用Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析柱和分子筛柱对获得的重组蛋白进行纯化,获得条带单一的纯蛋白.最后,制备了具有较高特异性和灵敏性的NteIF2α多克隆抗体,酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)检测结果表明,NteIF2α抗体的效价为1∶400 000.采用制备的抗体对NteIF2α在烟草K326不同组织的表达情况进行了检测,结果表明,NteIF2α在叶片中表达最高,在根、茎和叶片中的表达量较低或者不表达.本研究实现了NteIF2α蛋白的原核表达和纯化,制备了高效特异的NteIF2α抗体.研究结果为进一步探索植物eIF2α的功能及其参与的蛋白翻译调控机理提供了基础资料.