梅花鹿VEGF的原核表达与纯化

鹿茸是一个天然的细胞生长因子库,鹿体最活跃的部位是鹿茸顶端组织,里面含有大量的生长因子.这些生长因子可为鹿茸的临床作用研究提供生物化学基础,多种生长因子对鹿茸的增殖具有重要的促进作用.为了获得具有生物学活性的蛋白质,本研究将梅花鹿(Cervusnippon)血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)成熟肽基因与pET-30a连接构建VEGF基因原核表达载体,鉴定成功后,将pET-30a-VEGF转入Rosetta大肠杆菌(Escherichia coli感受态细胞进行诱导表达(0.6 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡哺半乳糖苷(isopropyl [β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG),20℃,16 h),并对表达产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测.目的蛋白通过Ni-Agarose柱试剂盒进行纯化,通过复性以获得生物学活性.再应用咪唑蓝(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT)法检测重组蛋白对小鼠成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast cell line,NIH3T3)的影响.鉴定结果显示,成功构建原核表达质粒;SDS-PAGE电泳结果表明,在Rosetta中成功检测到融合蛋白的表达;MTT法结果显示,不同浓度的重组蛋白均能促进NIH3T3的增殖,并且随着浓度的增加,细胞的增殖速度也随之加快;其中,蛋白添加量为200 ng/mL、孵育48 h时,增殖效果较为明显.研究结果将为深入探讨VEGF在鹿茸快速增殖过程中的功能和调控机理提供实验依据.