粪便具核梭杆菌的免疫磁珠捕获联合实时荧光定量PCR检测方法的建立及评价

目的 建立定量检测粪便中具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,F.nucleatum)的免疫磁珠捕获联合实时荧光定量PCR(IMBs-qPCR)技术方法.方法 5×108CFU F.nucleatum(0.4％甲醛灭活)免疫新西兰兔制备多克隆抗体,饱和硫酸铵沉淀法和Hi Trap Protein G HP亲和层析法纯化抗体;优化MS 300免疫磁珠偶联多克隆抗体和捕获F.nucleatum的反应条件.根据F.nucleatum特异性基因NusG设计引物和构建含目的基因的载体质粒,建立qPCR反应体系并绘制qPCR标准曲线.最后,在不同浓度(50 CFU/200 mg～ 105 CFU/200 mg)F.nucleatu的人粪便标本中,评价该方法的检测效能.结果 成功制备F.nucleatum多克隆抗体,抗体ELISA效价＞320 000,盐析和亲和层析纯化抗体纯度分别为60％和85％;多克隆抗体偶联免疫磁珠时偶联缓冲液最佳pH值为5.0,最佳温度为25℃,最佳偶联时间为2.5 h,加入抗体最适量为10 μg/mg,免疫磁珠最佳捕获温度为37℃,时间为40 min;成功建立qPCR反应体系;IMBs-qPCR和粪便全基因组DNA提取法直接检测模拟粪便标本最低检测限分别为100 CFU/200 mg和400 CFU/200 mg,ROC曲线中AUC分别为0.948和0.878.结论 成功建立了IMBs-qPCR检测粪便中F.nucleatum的方法,该方法具有简便快速、灵敏度高、特异性好等特点.