酵母双杂交系统筛选新橡胶延长因子HbREF3互作蛋白

橡胶延长因子(rubber elongation factor,REF)等橡胶粒子蛋白可能通过相互作用形成蛋白复合体在橡胶生物合成发挥作用.为鉴定REF家族中一新成员HbREF3的互作蛋白,以橡胶树HbREF3基因的cDNA序列为基础,分别构建了筛选HbREF3相互作用蛋白的3种诱饵载体pGBKT7-HbREF3-F(含全长ORF序列)及pGBKT7-HbREF3-N(含N端序列)和pGBKT7-HbREF3-C(含C端序列),并分别转化到Y2HGold酵母菌株中,进行诱饵表达载体的自激活性与毒性检测.实验证明,3种诱饵载体转化的酵母菌能在SD/-Trp平板上正常生长,而在SD/-Trp/-His/-Ade平板上不能生长,因此,诱饵载体本身没有自激活性,它们的表达产物也没有毒性,不影响转化酵母菌Y2H的生长,满足作为诱饵质粒的条件,并用于橡胶树胶乳cDNA酵母表达文库的筛选.结果表明,用HbREF3基因的全长ORF编码产物作诱饵,没有筛选到任何候选互作蛋白,而用HbREF3的N端和C端区域分别作诱饵,均筛选到了可能与HbREF3具有相互作用的候选蛋白,其中包括REF家族的其他成员和膜联蛋白D4等.