汉逊酵母重组表达的人胃蛋白酶原Ⅱ校准品研制

目的:探索一种高效制备人胃蛋白酶原Ⅱ(pepsiongenⅡ,PGⅡ)体外诊断试剂用校准品的方法.方法:以汉逊酵母ATCC26012作为宿主菌,以携带Zeocin及G418双重筛选标记的pRMHP2.1质粒为载体,以遗传密码子优化设计后的PGⅡ序列为目的基因,通过电转化及后续多轮次的传代与稳定,筛选获得高水平分泌表达PGII蛋白的重组菌株26012/PGⅡ.采用Ni柱亲和层析的方法从200L发酵罐大量制备的培养液中纯化出高纯度的重组PGⅡ蛋白,将该蛋白质进行校准定值后配制成6种不同浓度的成套PGⅡ校准品,并对该系列校准品的实时稳定性、加速破坏性及开瓶稳定性展开评价.结果:筛选获得的重组汉逊酵母菌株26012/PGⅡ外源基因整合拷贝数高于40个且整合于染色体的rDNA位置,该菌株以分泌形式表达重组PGⅡ蛋白,表达量超过50mg/L,发酵培养液经Ni柱亲和层析纯化后,重组PGⅡ蛋白纯度达93.8％.通过免疫比浊试剂盒定量检测,该PGⅡ蛋白的活性定值与实际蛋白质量之间的比值达0.85,配制后的PGⅡ校准品在4℃实时保存1年、37℃加速破坏2周及4℃开盖保存2周后,校准品定值的平均下降幅度都不超过10％,其稳定性能不逊色于商品化的校准品.结论:汉逊酵母重组表达的PGⅡ蛋白可用作体外诊断试剂的校准品.