肠小体感染猪传染性胃肠炎病毒模型的建立

来源于肠隐窝干细胞的肠小体能模拟体内肠上皮复杂的生理特性,已成为研究宿主与肠道病原相互作用的理想的体外细胞模型.为探究肠小体能否作为猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染模型,本研究从仔猪的回肠组织分离培养隐窝干细胞,在培养第7 d后能形成具有隐窝-绒毛样结构的肠小体.分别采用MOI 1、0.1和0.01 TGEV感染肠小体后,通过荧光定量PCR(qPCR)方法检测TGEV在肠小体中的复制情况,结果显示肠小体支持TGEV复制;进一步用MOI 1 TGEV感染肠小体后,通过qPCR检测并绘制TGEV在肠小体中的病毒复制曲线,结果显示,与2 hpi相比,在12 hpi病毒的mRNA转录水平增加了321倍,在24 hpi病毒复制达到峰值;通过间接免疫荧光(IFA)检测TGEV N蛋白的表达,结果显示N蛋白的表达情况与上述mRNA检测结果相符.通过双荧光标记IFA检测TGEV N蛋白与肠上皮细胞类型标志物的共定位情况,结果显示TGEV能感染多种肠上皮细胞类型,包括肠细胞、干细胞和杯状细胞.此外,通过qPCR检测TGEV感染肠小体的干扰素(IFN)mRNA转录水平,结果显示TGEV感染肠小体能显著增加IFN的产生.以上结果表明肠小体对TGEV易感,肠小体可以作为TGEV感染的体外细胞模型.本研究为探究TGEV与宿主之间的相互作用提供了一个全新的体外细胞模型,将有助于深入理解TGEV的致病机制.