H146-like鹅嵌杯病毒TaqMan-MGB PCR检测方法的建立及应用

为建立检测H 146-like鹅嵌杯病毒(GCV)的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank已登录的H146-like GCV基因组(KY399947)的NS基因保守区序列,设计合成一对能够特异性扩增134 bp片段的特异性引物(GCV-QP3/GCV-QP4)和TaqMan-MGB探针(GCV-Probe),经过反应体系和条件优化,建立了检测H146-likeGCV的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法.当质粒标准品为5.07×102拷贝/μL～5.07× 109拷贝/μL时,荧光定量标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数可达0.995.特异性试验结果显示,该方法对水禽常见病毒(如鹅星状病毒、鹅副粘病毒、鹅细小病毒、番鸭呼肠孤病毒、Ⅰ型鸭肝炎病毒与鸭坦布苏病毒等)的检测均为阴性,仅对H146-like GCV检测为阳性,特异性较强;敏感性试验结果显示,该方法可以检测到的最低质粒标准品为5.07×102拷贝/μL,而常规PCR方法检测该质粒标准品最低为5.07×104拷贝/μL,敏感性高;批内和批间的变异系数均小于1.6％,重复性良好.对福建省62份疑似临床组织样品进行检测,结果显示TaqMan-MGB探针荧光定量PCR方法阳性检出率为93.5％(58/62),而常规PCR方法的阳性检出率为72.6％(45/62),两种方法的符合率为77.59％.本研究建立的荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏性高,重复性好,在H146-like GCV的快速检测中具有良好的应用前景.