H5和H7亚型高致病性禽流感病毒新型冻干微芯片双重荧光定量RT-PCR方法的建立和初步应用

为建立鉴别检测H5和H7亚型高致病性禽流感病毒(HPAIV)双重荧光定量RT-PCR检测方法,本研究根据已登录的H5和H7亚型HPAIV HA基因裂解位点序列差异分别设计引物和探针,对反应体系各条件优化后首次建立了同时鉴别检测H5与H7亚型HPAIV的新型冻干微芯片双重荧光定量RT-PCR方法.特异性试验结果显示,该方法除对H5和H7亚型HPAIV检测结果为阳性外,对其它几种常见的禽病病原检测结果均为阴性,该方法特异性强;敏感性试验结果显示,该方法检测下限为病毒浓度1×101 TCID50/mL,而常规荧光定量RT-PCR检测下限为1×102 TCID50/mL,敏感性高;标准曲线分析后结果显示,本研究所建立方法的扩增效率比常规荧光定量RT-PCR高,二者相关系数均为0.997;批内和批间重复性试验结果显示,Ct值的变异系数均小于2％以下,重复性高.临床样品检测结果显示,该方法所需样本微量仅为1 μL～2 μL;操作简便、快速,检测过程＜40 min,可用于现场检测;而且利用该方法与常规荧光定量PCR方法以及测序对临床样品进行检测,三者结果完全吻合.本研究所建立的新型冻干微芯片双重荧光定量RT-PCR检测方法为H5和H7亚型HPAIV监测和临床检测提供了可行的技术手段.