猪瘟病毒亚基因复制子及其细胞系的构建

为探索猪瘟病毒(CSFV)的复制机理,本实验在前期CSFV流行株GD53全基因组测序的基础上,利用新霉素抗性基因(Neor)替换病毒结构蛋白基因以构建CSFV GD53株的亚基因组复制子(GD53-SGR).首先构建含有T7-5'UTR-Npro-Neor-EMCV/IRES-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-3'UTR的重组质粒pcDNA-GD53-SGR,将其利用T7 RNA聚合酶经体外转录制备的RNA转录本转染猪睾丸细胞系(ST)后,利用G418筛选含有GD53-SGR的ST细胞,构建ST-GD53-SGR细胞系.酶切鉴定及测序结果表明,重组质粒pcDNA-GD53-SGR构建正确,利用T7 RNA聚合酶体外转录后获得了与预期大小一致的GD53-SGR RNA.经RT-PCR和间接免疫荧光鉴定结果表明,获得了含有GD53-SGR的ST细胞系.本研究构建的CSFV ST-GD53-SGR细胞系有助于进一步了解CSFV非结构蛋白的功能,同时为CSFV的复制机制研究及抗病毒药物的研发奠定基础.