香菇草酰乙酸水解酶基因LeOAH1克隆及表达分析

草酰乙酸水解酶(Oxaloacetate acetylhydrolase/Oxaloacetate hydrolase)是香菇(Lentinula edodes)中草酸合成的关键性酶,克隆香菇LeOAH1,并分析其在香菇体内与体外的表达情况,旨为研究香菇LeOAH1的功能奠定基础.从香菇L808中克隆LeOAH1,并进行生物信息学分析,采用RT-PCR和高效液相技术检测LeOAH1在不同pH条件下香菇菌丝内的表达情况和草酸含量.此外,构建了重组原核表达载体pET28a-oah1,在大肠杆菌中进行体外表达.基因克隆结果表明,该基因的gDNA长度为1906 bp,cDNA长度为1356 bp,编码氨基酸数量为451个,蛋白分子质量约为48.9 kD,等电点为6.80.生物信息学分析表明:该酶为不稳定的疏水性蛋白,具有α-螺旋(40.08％)、无规则卷曲(34.59％)、延伸链(17.52％)、β-折叠(7.10％)4种二级结构;亚细胞定位在细胞质中;序列比对的结果显示该酶有保守结构域;系统发育树分析该蛋白,与日本香菇OAH的相似度最高,同源性为82％;其次是灰光柄菇,同源性为64％.RT-PCR、HPLC的结果显示:在不同pH条件下,随着pH增加,LeOAH1基因表达量增加,香菇草酸分泌量也随之增加.而大肠杆菌中诱导表达的蛋白分子量符合预测结果.初步明确了香菇草酰乙酸水解酶的基因特性以及表达规律,以及与草酸分泌的关系.