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CRISPR/Cas9系统介导的miR-155基因敲除细胞的 制备

Cong-cong LI, Yong-hui ZHANG, Wan-xia ZHAO,Jiao WU,Hao-yuan HAN,Meng-yun LI,Hui NIU,Su-fang SONG,Wan-tao LI

Biotechnology Bulletin（2019）

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Abstract
为研究miR-155基因在猪肺泡巨噬细胞系(3D4/21)中的功能,采用CRISPR/Cas9系统构建miR-155敲除的猪肺泡巨噬细胞系.首先,采用sgRNA-cas9程序,设计4个靶向miR-155的特异性sgRNA引物序列.然后构建sgRNA表达载体,与pEGFP-C1-cas9载体共转染3D4/21细胞,进行流式分选并富集表达绿色荧光蛋白GFP的细胞.最后,采用T7E I酶酶切、Sanger测序、实时荧光定量PCR(qPCR)、western blot等方法检测敲除效率,发现miR-155基因可以被以上4个sgRNA编辑,其中sgRNA39的敲除效率最高,T7E I酶酶切检测流式分选后的敲除效率有42％;Sanger测序显示sgRNA39细胞系敲除31个碱基;RT-qPCR结果显示miR-155-5p/3p表达量均有下降;western blot结果表明miR-155靶基因SHIP1的蛋白表达量升高.成功构建miR-155敲除的3D4/21细胞为进一步探讨miR-155在巨噬细胞发挥的调控功能研究提供细胞模型.
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