黄瓜细菌性角斑病PMA-qPCR检测方法的建立和应用

黄瓜细菌性角斑病为黄瓜常见的一种细菌病害,其致病菌为丁香假单胞菌黄瓜致病型.目前该病在全球范围内已经造成严重的经济损失.针对于PMA染料能够区分细胞死活的特性将其与荧光定量PCR技术结合.(1)通过比对分析GenBank中该菌种不同株的gap1基因序列,找出gap1基因的保守区并根据保守区基因序列设计了一对特异性引物Dxf1和Dxr1,以其他5种非丁香假单胞菌基因组为模板进行实时定量PCR扩增,只有丁香假单胞菌有扩增曲线,证明引物非常特异.(2)以gap1基因为目的基因构建其克隆载体,将克隆载体导入到大肠杆菌感受态细胞中进行培养,使其大量复制.再将质粒提取,以提取的质粒作为标准品,根据其浓度将其稀释为5×101-5×1077个梯度绘制标准曲线,获得的扩增效率为96.6％,并做组内重复和组间重复,变异系数均在2％内,证明标准曲线重复性良好.(3)将构建好的方法用于实际样品的检测,得到的Ct值为27.99,根据标准曲线所得的起始模板与Ct值之间的线性关系公式,检测到100 mg患病叶片中含有的菌体为7.69×102拷贝.研究表明,该方法可以快速鉴定并检测实际样品中的活的致病菌的数量,为黄瓜细菌性角斑病的防控提供技术支持.