建立CRISPR/Cas9慢病毒系统高效敲除人源AIP1基因

旨在构建AIP1基因CRISPR/Cas9敲除体系，获得高效、稳定、永久性AIP1敲除的人胚肾细胞株（293T）。针对AIP1的外显子设计3个20 bp的sgRNA（sp1、sp2和sp3）。与PX458载体连接，构建PX458-sgRNA敲除表达载体。T7E1实验评估敲除效率。将敲除效率最高的sgRNA与lentiCRISPRv2慢病毒载体连接，构建lentiCRISPRv2-sgRNA敲除表达载体，将阳性重组质粒导入病毒包装细胞293T中，收集病毒上清液转染293T细胞。对敲除成功的293T细胞通过有限稀释法构建敲除AIP1基因的稳定细胞株。Western blot测定转染后293T细胞中AIP1蛋白的表达量。结果显示，测序证实AIP1的3个靶序列分别正确插入PX458表达载体中，T7E1实验证实AIP1sgRNAsp2靶向敲除效率最高；成功构建lentiCRISPRv2-sgRNAsp2 AIP1敲除表达载体，并包装病毒，感染293T细胞；Western blot证实获得稳定的AIP1基因表达缺失的293T细胞株。建立了能稳定敲除AIP1基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统，成功获得AIP1敲除的293T稳定细胞株。