基于高通量测序鉴定细菌RNA加工位点方法的开发
Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology（2020）
Abstract
简便的RNA剪切加工位点鉴定方法对于细菌核糖核酸内切酶功能和转录后水平调控机制的研究至关重要.本研究基于第二代测序技术,开发了一种能够精确鉴定RNA剪切加工位点及其剪切效率的高通量测序方法.在该方法中,首先将各种潜在RNA剪切加工的DNA片段分别克隆至报告系统进行转录,然后利用其下游特异引物进行反转录,直接构建约500 bp的双端测序cDNA文库,并在Illumina MiSeq平台对该文库进行测序.最后通过对reads 5'末端的比对定位,精确测定发生RNA剪切的位点.利用该方法,成功鉴定了来自Ruminiclostridium Cellulolyticum的cip-cel mRNA中的3个RNA剪切加工位点.与传统引物延伸和5'RACE等方法相比,该方法不仅具有更高的安全性和通量,同时还可像Northern印迹鉴定RNA的剪切效率.
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Key words
high-throughput sequencing,cDNA library,RNA processing site,efficiency of RNA cleavage
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