胞浆接头蛋白Dok5的表达及生物信息学分析

[目的]构建携带小鼠Dok5基因及其PH、PTB结构域的原核表达载体,并表达对应GST融合蛋白.[方法]从小鼠脑组织提取总RNA,逆转录后经PCR扩增、酶切、连接及转化大肠杆菌DH5α,构建携带Dok5全长(FL)、PTB、PH结构域的原核表达质粒,经酶切及测序鉴定之后,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达蛋白,再利用Glutathion Sepharose 4B亲和层析柱纯化得到融合蛋白,并通过Western Blotting检测其与相应抗体的反应性.利用生物信息学相关软件(ClustalW2、ProtParam、ProtScale、NetPhos 2.0 Server、SOPMA、Swissmodel)预测Dok5蛋白的理化性质和磷酸化位点以及二、三级结构.[结果]构建了小鼠Dok5 FL、PH、PTB的原核表达质粒,并得到了浓度分别为0.3mg/ml、0.6 mg/mL、1 mg/mL的pGEX 6p-1-Dok5 FL、PH、PTB蛋白,其中Dok5 FL融合蛋白与相应抗体具有良好的反应性.Dok5长度为921 bp,编码306个氨基酸,在人、鼠、猴中高度保守.Dok5相对分子质量为35.453 kDa,理论pI为9.0,包含50个潜在磷酸化位点.[结论]分别得到了63 kDa、39 kDa、37 kDa的Dok5 FL、PH、PTB的GST融合蛋白,预测Dok5是一种亲水性的不稳定蛋白.