慢病毒介导的低表达RNF20肝癌稳转细胞系的构建及其生物学功能分析

该文探讨了环指蛋白(RNF20)缺陷对肝细胞肝癌的细胞增殖和迁移的影响,及其可能的作用机制.针对RNF20基因设计3组短发夹RNA序列(RNF20-shRNA1、RNF20-shRNA2和RNF20-shRNA3),通过构建pLent-U6-GFP-Puro-shRNF20慢病毒载体,包装慢病毒后感染人肝癌细胞SMMC-7721和Huh7,经嘌呤霉素抗性筛选建立RNF20敲低的肝细胞肝癌稳转细胞系.同时,设感染对照慢病--pLV-shCtrl-EGFP的对照组(shCtrl-7721/shCtrl-Huh7).实时荧光定量PCR检测RNF20 mRNA表达,荧光显微镜观察其绿色荧光蛋白表达,免疫荧光染色法和蛋白免疫印迹法检测RNF20、T-Akt及p-Akt蛋白的表达情况,BrdU掺入实验及CCK-8法检测各组细胞增殖能力,划痕实验检测各组细胞迁移能力,转录组测序分析基因转录水平.结果 显示,RNF20-shRNA2对应肝癌细胞中的RNF20 mRNA表达最低,稳转细胞感染效率均高于85％,RNF20缺陷的SMMC-7721和Huh7较对照组细胞内RNF20、Weel、p27、p53基因转录水平及NF20蛋白表达水平明显降低,增殖与迁移能力明显增加,且p-Akt蛋白表达上调.Akt抑制剂派立福新处理的RNF20缺陷的肝癌细胞较未处理组增殖与迁移能力降低.实验结果提示,RNF20下调后促进肝癌细胞体外增殖与迁移,且其可能通过Akt通路进行调节.