人GINS2基因酵母双杂交诱饵质粒的构建及自激活检测

目的 构建人GINS2基因酵母双杂交诱饵质粒,并进行自激活检测.方法 根据GenBank中登录的GINS2基因编码区序列(NM_016095)设计引物,以pCDNA3.1-GINS2质粒为模板进行PCR扩增,将PCR产物克隆至诱饵载体pGBKT7上,构建诱饵质粒pGBKT7-GINS2.将鉴定正确的诱饵质粒及对照质粒共同转化至酵母细胞AH109中培养,Western blot法检测诱饵蛋白GINS2的表达,随机挑取6个菌落,进行His3、Ade2及LacZ报告基因的自激活效应检测.结果 经双酶切及测序鉴定证明诱饵质粒pGBKT7-GINS2构建正确.诱饵蛋白GINS2相对分子质量为21 000,可在AH109酵母细胞中稳定表达.诱饵质粒转化的酵母细胞在SD/-Trp/-Leu缺陷平板生长,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷平板上不生长,表明报告基因His、Ade2未被激活,报告基因LacZ检测结果与阴性对照相同,表明诱饵蛋白GINS2不存在自激活.结论 成功构建了人GINS2基因酵母双杂交诱饵质粒,其表达蛋白对酵母AH109细胞无毒性,也无自激活现象,可用于后续蛋白筛选试验.