一种基于VP6基因的A组轮状病毒拷贝数实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的 建立一种基于VP6基因的A组轮状病毒(rotavirus,RV)拷贝数的实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测方法.方法 提取病毒液中RV基因组RNA,经RT-PCR扩增VP6基因片段,回收PCR产物克隆至pMD-19T载体,将鉴定正确的阳性菌株常规培养制备标准品质粒,建立RT-qPCR病毒拷贝数检测方法,以标准品质粒Ct值为横坐标,拷贝数的对数为纵坐标绘制标准曲线,依据标准曲线方程检测样品中RV拷贝数.结果 标准品质粒经酶切及测序鉴定证明构建正确;获得RV标准品质粒的标准曲线方程为y=-0.2463x+10.957,R2=0.995 5;原倍及稀释度为1×10-3的样品溶液的RV病毒拷贝数分别为265 319.903 5、1 682.228 735 copies/μL.结论 建立的RT-qPCR拷贝数检测方法,能在早期快速准确的检测RV,该方法稳定性较好,可据此标准曲线方程对样品中的RV进行绝对定量,为RV研究及临床检查提供了检测工具.