重组人胃蛋白酶原Ⅰ在汉逊酵母中的分泌表达、纯化及其应用

目的 实现人胃蛋白酶原Ⅰ (pepsiongen Ⅰ,PGⅠ)在汉逊酵母表达系统中的高效分泌表达,并将纯化的重组PG Ⅰ蛋白制备成体外诊断试剂用校准品.方法 根据汉逊酵母遗传密码子偏爱性优化设计并合成PG Ⅰ基因,克隆至表达载体pRMHP2.1中,电转化汉逊酵母宿主菌26012,进行多次传代及稳定,筛选高水平分泌表达PG Ⅰ的菌株,并对该菌株的目的基因整合位置及整合拷贝数进行检测.应用200 L发酵罐大规模制备发酵培养液,通过Ni柱亲和层析方法纯化获得重组PG Ⅰ蛋白,经胶乳增强免疫比浊试剂盒进行PG Ⅰ蛋白的定值,应用类血清基质液制备100及50 μg/L浓度的PG Ⅰ校准品后检测稳定性.结果 重组表达质粒pRMHP2.1-PG Ⅰ经双酶切及测序鉴定证明构建正确.筛选获得的重组汉逊酵母菌株分泌表达的PG Ⅰ蛋白相对分子质量约45 000,表达量达100 mg/L以上,其外源基因整合于宿主rDNA位置,整合拷贝数不低于20个.纯化后的重组PGⅠ蛋白纯度为94.5％,配制后的PG Ⅰ校准品经4℃实时保存稳定性、37℃加速破坏性及4 ℃开盖保存稳定性试验,校准品定值的平均下降幅度均不超过10％.结论 应用汉逊酵母表达系统可高效分泌PG Ⅰ蛋白,该蛋白具有良好的稳定性,可用作体外诊断试剂的PG Ⅰ校准品.