Benzonase酶去除流感疫苗中Vero细胞DNA条件的优化

目的 优化非限制性内切酶Benzonase去除Vero细胞制备的H5N1流感疫苗中残余细胞DNA的条件,并结合两步柱层析法使疫苗中DNA残余达到质量要求.方法 向H5N1流感病毒浓缩液中添加不同终浓度的Benzonase酶(10、20、30、40、50、60 U/ml),置于37℃酶解不同时间(0.5、1、1.5、2、2.5、3h),经100 kD超滤离心管,用不同pH(7.10、7.30、7.50、7.70、7.90)的PBS进行洗滤浓缩.将Benzonase酶处理的病毒液经蔗糖密度梯度离心纯化,去除部分杂蛋白,电镜下观察病毒的形态.结合两步柱层析法进一步去除Vero细胞DNA.结果 H5N1流感病毒液经终浓度为10 U/ml的Benzonase酶,37℃处理2.5h后,用pH为7.50的PBS溶液进行洗滤,其DNA去除率可达99％以上.Benzonase酶处理前后病毒形态一致,结构完整,轮廓清晰.在用酶处理去除原液中大部分Vero细胞残余DNA的基础上,结合两步柱层析法基本可使疫苗残余外源DNA达到100 pg/剂的限定标准.结论 非限制性核酸内切酶Benzonase可高效降解H5N1流感病毒液中的DNA,此方法降低流感疫苗中Veto细胞DNA简单可行,大大降低了后续工艺去除DNA的压力,同时结合两步柱层析法可使疫苗中DNA残余达到限定标准,为以Vero细胞为基质大流行流感疫苗的研发奠定了基础.