鼠源Bif-1蛋白7种选择性剪接异构体真核表达质粒的构建及鉴定

目的 构建鼠源Bif-1 (Bax-interacting factor-1)蛋白7种选择性剪接异构体(alternatively spliced isoforms)真核表达质粒,并在BHK和N2a细胞中表达.方法 以提取的N2a细胞总RNA为模板,采用RT-PCR、重叠延伸PCR等方法扩增目的基因Bif-1(transcript variant 1 、transcript variant 2、transcript variant 3 、transcript variant x1、transcript variant x2、transcript variant x3、e),并将目的基因连入真核表达载体pIRES2-EGFP,构建重组质粒.重组质粒经鉴定正确后经脂质体介导转染BHK和N2a细胞,采用荧光显微镜观察及Western blot法检测转染细胞中Bif-1蛋白的表达.结果 琼脂糖凝胶电泳可见与预期大小相符的核酸条带;重组质粒经PCR、双酶切、测序鉴定证明构建正确;重组质粒转染BHK或N2a细胞后荧光显微镜下可见绿色荧光;Westen blot可检出相应大小的目的条带.结论 成功构建了鼠源Bif-1蛋白7种选择性剪接异构体真核表达质粒,并在BHK和N2a细胞中获得表达.为进一步探索Bif-1蛋白不同选择性剪接异构体的生物学功能,研究其在细胞自噬、细胞凋亡以及抗肿瘤等方面的作用奠定了基础.