西尼罗病毒抗体间接ELISA检测方法的建立、验证及其应用

目的 建立及验证西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)抗体间接ELISA检测方法,并用于评价疫苗的免疫效果.方法 以纯化后的WNV E蛋白第三结构域(EDⅢ)蛋白作为包被抗原,建立WNV抗体间接ELISA检测方法,对抗原包被浓度(2.5、5、10、20、40、80 μg/ml)、血清稀释度(1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320)、抗原封闭时间(0.5、1、1.5、2h)、血清孵育时间(0.5、1、1.5、2h)、HRP标记的山羊抗马IgG稀释倍数(1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000、1∶40 000、1∶80 000稀释)及其孵育时间(0.5、1、1.5、2h)进行优化,并验证该方法的特异性、敏感性及精密性.采用建立的方法检测WNV阴性马血清和病毒样颗粒(WNV-VLPs)疫苗免疫的马血清,与ALPHA公司试剂盒的检测结果进行比较.结果 间接ELISA法最佳检测条件为:抗原包被浓度为20 μg/ml,4℃包被过夜;Blocking ACE封闭液于37 ℃封闭1.5h;加入血清(1∶80稀释),37℃孵育1.5h;加入HRP标记的山羊抗马IgG(1∶20 000稀释),37℃孵育1h.该方法可特异性检测WNV阳性血清中的WNVE-IgG抗体;阳性血清稀释至1∶2 560时,检测结果仍为阳性;批内和批间的变异系数(CV)均小于7％.25份WNV阴性马血清检测结果均为WNVE-IgG抗体阴性,经WNV-VLPs疫苗免疫的马血清中的WNVE-IgG抗体效价水平随免疫次数的增加呈递增趋势,间接ELISA法与ALPHA公司试剂盒的检测结果完全一致.结论 成功建立了WNV抗体间接ELISA检测方法,可用于疫苗免疫效果的评价,为开展WNV流行病学调查、诊断及新型疫苗的研发奠定了基础.