重组铜绿假单胞菌外毒素A含量SDS-PAGE检测方法的建立及验证

目的 建立测定重组铜绿假单胞菌外毒素A(recombinant exotoxin of Pseudomonas aeruginosa,rEPA)含量的SDS-PAGE法,并进行验证.方法 采用SDS-PAGE,经考马斯亮蓝R-250染色后,利用Image Lab软件分析获得目标蛋白条带光密度值,计算目标蛋白在待测样品中的含量.对建立的方法进行专属性、准确性和重复性验证,确定检测范围,并用建立的方法检测rEPA宿主湿菌体中rEPA发酵产量及rEPA宿主菌休克液柱层析纯化样品中rEPA含量.结果 rEPA含量在100～600 μg/ml范围内与其对应条带的光密度值具有良好的相关性,决定系数在0.97以上.大肠埃希菌固有组分及纯化过程中常用的添加物对rEPA含量检测均未产生明显影响,专属性较好;用建立的方法检测500、300、150μg/ml rEPA样品10次的回收率分别为(102.32±4.18)％、(102.77±4.94)％和(95.04±16.41)％,CV值分别为4.08％、4.81％和17.27％.各批rEPA发酵产量为250 ～ 500 mg/L,三步柱层析纯化后,rEPA总回收率约为50％.结论 建立了测定rEPA含量的SDS-PAGE法,该方法专属性、准确性和重复性良好,为rEPA生产工艺的优化奠定了基础.