流感病毒裂解疫苗中游离的痕量甲醛反向HPLC检测方法的建立

目的 建立测定流感病毒裂解疫苗中游离的痕量甲醛的反向HPLC法.方法 优化衍生化条件后,2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine,DNPH)衍生流感病毒裂解疫苗中游离的甲醛,利用反向HPLC法进行痕量甲醛的测定,色谱条件:色谱柱:TC-C18(250mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈-水(45∶55);进样量:10μl;流速:1.0 ml/min;检测波长:360 nm;柱温:35℃.确定DNPH衍生物的检测波长,对建立的方法进行线性、准确度、精密度、稳定性、重现性验证,确定方法的定量限及检出限.取4批不同厂家的流感病毒裂解疫苗,按建立的方法,2批衍生化、2批直接进行痕量甲醛检测.结果 确定衍生化溶液为磷酸溶液(5 mol/L),衍生温度为20℃,30 min为最终体系反应时间.DNPH衍生物的检测波长为360 nm.甲醛浓度在10.02 ～ 250.5 ng/ml范围内,与峰面积呈良好的线性关系,R2=0.999 8;6份甲醛DNPH衍生物样品检测的平均回收率为99.93％,RSD为0.34％;甲醛DNPH衍生物样品连续重复进样6次的峰面积均值为724.15,RSD为0.74％;甲醛DNPH衍生物不同时间重复6次检测的痕量甲醛平均为8.04 μg/ml,RSD为0.98％,24 h内稳定性好;6份同批样品的游离痕量甲醛平均为8.06 μg/ml,RSD为0.68％;痕量甲醛的最低检出限为0.01 μg/ml,定量限为0.03μg/ml.4批流感病毒裂解疫苗痕量甲醛均低于《中国药典》三部(2010版)中规定的50 μg/ml.结论 本文建立的流感病毒裂解疫苗中游离痕量甲醛的反向HPLC检测方法,具有简单、高效、灵敏、痕量等特点,适用于疫苗中游离痕量甲醛的测定.