大肠埃希菌O157∶H7新型多重PCR检测方法的建立及其初步应用

目的 建立一种能够满足现场快速检测、完全脱离实验室仪器设备的大肠埃希菌O157∶H7多重PCR检测方法.方法 利用大肠埃希菌O157∶H7抗原基因保守序列fliCh7和rfbE设计2对引物,并对Palm PCR G1-12退火温度、循环数、引物浓度及引物最佳比例进行优化,建立微量快速检测大肠埃希菌O157∶H7的多重PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性进行验证.取疑似病牛粪便共9份,利用粪便DNA提取试剂盒提取DNA,按照建立的PCR方法进行扩增,扩增产物经微型电泳仪电泳检测并照相.结果 确定大肠埃希菌O157∶H7 PCR的最佳退火温度为54℃,循环数为25个循环,上下游引物浓度为10 μmol/L,2对引物最适比为fliCh7∶rfbE=1∶3.大肠埃希菌O157∶H7扩增产物可见625 bp(fliCh7)和213 bp (rfbE)的特异性片段,而大肠埃希菌(ATCC25922)、猪链球菌2型、金黄葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、小肠耶尔森菌、单增李斯特菌、沙门菌的PCR检测结果均为阴性,最低扩增DNA浓度为10 pg/μl,重复扩增5次均可见目的条带.9份疑似病牛粪便样品中,共检测出7份大肠埃希菌O157∶H7阳性样品.结论 建立了大肠埃希菌O157∶H7微量快速多重PCR检测方法,该方法特异性、灵敏性和重复性均良好,可在现场约1h报告结果,对突发性传染病的防治具有重要意义.