LC3基因沉默对小鼠肝癌细胞Heap1-6凋亡影响的研究

目的 建立小鼠LC3基因沉默的Heap 1-6稳定表达细胞系,探讨其对衣霉素诱导的肝癌细胞凋亡的影响.方法 设计并合成一段针对小鼠LC3基因的shRNA及不针对任何基因的shRNA作为阴性对照,将它们退火后连接构建重组载体,转化扩增及酶切鉴定之后将重组质粒与病毒包装、包膜质粒共同转染293T,收集病毒上清转染Heap1-6细胞,嘌呤霉素筛选10d,获得稳定的细胞株.以导入LC3基因shRNA的Heap1-6为实验组(Heap1-6 shLC3),以导入shcoo2的Heap1-6为对照组(Heap1-6 shctrl).衣霉素处理实验组和对照组的细胞,Western Blot检测LC3 Ⅱ、c-Caspase3、Caspase9蛋白的表达,流式细胞术检测细胞凋亡.Western Blot 条带灰度值之间两组比较采用独立样本的t检验.结果 成功构建了pLKO.1-shLC3重组慢病毒载体,与野生型的Heap1-6相比,LC3基因沉默之后,LC3 Ⅱ蛋白表达水平降低了62.9％(P＜ 0.01);野生型的Heap1-6和LC3基因沉默之后的Heap1-6 shLC3都经Tm处理12h之后,后者LC3 Ⅱ蛋白表达水平降低了58.6％(P＜0.01).与对照组Heap1-6 shctrl相比,衣霉素作用12h后实验组Heap1-6 shLC3 c-Caspase3增加了37.7％ (P=0.007),Caspase9增加了37.1％(P=0.023));衣霉素作用24 h后shLC3组c-Caspase3增加了12.6％ (P=0.04),Caspase9增加了14.3％ (P=0.043).药物干预12h和24 h后,Heap1-6 shLC3组比对照组Heap 1-6 shcoo2凋亡比例分别增加22.8％和18.6％.结论 成功建立小鼠LC3基因沉默的Heap1-6稳定表达细胞系,LC3基因沉默促进衣霉素诱导的小鼠肝癌细胞Heap1-6的凋亡.