人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体稳定过表达基因工程修饰人脐带间充质干细胞亚细胞系的建立

目的 通过基因工程修饰法建立肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)稳定过表达的人脐带间充质干细胞亚系(hUC-MSC_TRAIL).方法 人TRAIL全长蛋白编码序列(CDS)由PCR法扩增而得,PCR产物经Not Ⅰ和MluⅠ双酶切并纯化后,亚克隆至经同样双酶切的慢病毒表达载体pLEX-MCS.重组载体经PCR法和限制性内切酶酶切法鉴定,再行DNA直接测序验证后命名为人TRAIL表达慢病毒载体pLEX-h TRAIL.pLEX-hTRAIL与相应包装质粒psPAX2和pMD2.G经聚乙烯亚胺介导共转染HEK293T细胞以包装慢病毒.P4代hUC-MSC经慢病毒感染24 h,再行嘌呤霉素筛选2周后,抽提细胞基因组DNA,行PCR法鉴定hTRAIL cDNA在hUC-MSC基因组中的整合情况;同时抽提细胞总RNA,并行RT-PCR法检测外源hTRAIL在hUC-MSC中的mRNA表达水平,以及实时定量RT-PCR法检测周期调控相关蛋白Cyclin D1、Cyclin E1、p21WAF1/CIP1和p27的表达,采用方差分析和t检验进行统计学分析.结果 PCR法和限制性内切酶酶切法鉴定结果表明,本研究己成功构建人TRAIL慢病毒表达载体pLEX-h TRAIL,直接DNA测序结果证实克隆得到的人TRAIL蛋白编码序列准确无误;病毒包装及细胞感染的鉴定结果说明,慢病毒感染法可成功介导外源人TRAIL在hUC-MSC的稳定整合和高表达;实时定量RT-PCR法检测结果则显示,与对照慢病毒感染后的细胞相比.hTRAIL表达慢病毒感染后其细胞周期调控相关蛋白Cyclin D1、Cyclin E1、p21WAF1/CIP1和p27的mRNA表达水平分别是对照组的1.19倍(P=0.141)、0.94倍(P=0.745)、0.95倍(P=0.047)和1.01倍(P=0.567),表明外源TRAIL高表达对体外培养的hUC-MSC生长增殖等表型无显著影响.结论 本研究经基因工程修饰法成功构建了具外源TRAIL稳定高表达的hUC-MSC亚细胞系,该亚细胞系的建立为后续靶向攻击TRAIL敏感肿瘤细胞的细胞治疗的探索奠定了基础.