河弧菌paar基因功能研究

目的 研究河弧菌85003 Ⅵ型分泌系统VflT6SS2核心基因簇上游aar基因(AL536_RS29530)编码蛋白的结构特征、功能及其对河弧菌VflT6SS2功能的影响.方法 利用自杀质粒介导的同源重组技术构建paar基因缺失株,PCR扩增并克隆paar基因于pSRKTc表达载体获得回补质粒,导入相应缺失株得到回补株.Western Blot(WB)检测缺失株和回补株中T6SS效应蛋白Hcp的表达和分泌,细菌杀菌实验检测菌株杀菌毒力变化.荧光定量反转录聚合酶链式反应检测tssB2和hcp mRNA表达水平.启动子-Lux报告系统的冷光表型检测确定VflT6SS2核心基因簇启动子及hcp启动子在野生株和缺失株背景下的活性差异.结果 成功构建河弧菌85003的paar基因的精确缺失株和相应的回补株;WB检测缺失株中Hcp的表达和分泌较野生株明显降低,同时其对大肠埃希菌的菌间杀伤能力也降低,导入相应回补质粒可使缺失株Hcp的表达、分泌和杀菌表型恢复到野生株水平;hcp和tssB2的mRNA水平检测显示缺失株低于野生株,差异有显著性,但VflT6SS2核心基因簇的启动子活性和hcp启动子活性在野生株及缺失株中无明显差异,提示paar基因可能在转录后水平调控VflT6SS2.结论 河弧菌中paar(AL536_RS29530)基因编码产物是河弧菌VflT6SS2的组成部分,为其功能所需,缺失该基因导致VflT6SS2的分泌和杀菌能力缺陷,但其具体的调控机制有待进一步研究.