食品中志贺活菌叠氮溴乙锭实时荧光聚合酶链反应技术研究

目的 利用叠氮溴乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)实时荧光聚合酶链反应(PCR)技术,建立一种简便、快速、特异、灵敏的在食品中检测志贺活菌的方法.方法 根据志贺菌ipaH基因保守序列设计特异性引物和探针.用不同EMA浓度、不同光照次数优化样品EMA前处理条件.用已知菌验证志贺活菌检测的敏感性和志贺死菌检测的抑制性.用31株志贺菌、26株单增李斯特菌、24株沙门菌、25株副溶血弧菌、11株阪崎肠杆菌、10株致病性大肠埃希菌和1株大肠埃希菌验证方法的特异性和稳定性.同时用本研究方法和常规分离培养法,对30件模拟样品进行实样验证.结果 志贺活菌EMA实时荧光PCR方法的循环阈值(Ct) =32.10 ～3.19 xlog(菌量)(R2=0.994).最低检测浓度为2.20 CFU/反应.对死菌DNA抑制效率≥99.97％.31株志贺菌Ct值最低为15.04,最高为26.54,而97株非志贺菌的Ct值均＞35或无Ct值(呈一条直线).重复试验Ct值变异系数＜3.30件模拟样品采用本研究方法和常规分离培养法的检测结果一致,但采用EMA实时荧光PCR方法耗时不超过7.5h,而常规分离培养方法则需要3～5d.结论 EMA实时荧光PCR技术是一种快速简便、特异性强、灵敏度高、仅检测志贺活菌的方法,建议在食品检测中推广应用.