冻干重组结核杆菌融合蛋白(EC)原液效力评价用国家参考品的初步建立

目的 以冻干重组结核杆菌融合蛋白(EC)[该制品名称是国家药典委员会确定的药品中文通用名称,“EC”为重组融合蛋白“结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)”](以下简称“EC”)原液为原材料,研制EC变态反应原原液效力评价用国家参考品.方法 以电泳法、高效液相色谱法分别测定备选EC原液纯度,纯度合格后经精密称量、分装、冻干制成候选国家参考品,再测定其蛋白质和水分含量.将候选国家参考品稀释成不同稀释度后,皮内注射结核分枝杆菌活菌致敏的豚鼠,根据皮肤试验硬结或红晕反应平均直径大小(简称“反应平均直径大小”)结果探索原液效价测定的适宜稀释度.在此基础上,将候选国家参考品用于EC原液的效价测定并进行方法验证,初步评价其适用性能.研究还初步观察了候选品在-20℃放置24个月的稳定性.结果 EC原液电泳法纯度为100.00％,高效液相色谱法纯度为95.33％,候选国家参考品蛋白质含量为508 μg/瓶,水分含量为1.57％,分装精度控制在±1％以内.稀释度探索结果显示:候选品稀释度为2.5 μg/ml(12.5U/ml)、5μμg/ml(25 U/ml)和10 μg/ml(50 U/ml)时剂量对数反应平均直径大小曲线有良好的线性关系(R2=0.9944),可作为后续研究的适宜稀释度.将候选国家参考品用于EC原液效价测定,两者剂量对数反应平均直径大小曲线趋势基本一致(R2=0.9878,R2=0.9643),且每个稀释度EC原液与相应稀释度候选国家参考品反应平均直径大小的比值均满足1.0±0.2.方法 验证结果显示:候选国家参考品和EC原液的剂量对数反应平均直径大小曲线趋势基本一致(R2=0.9999,R2=0.9815),且两者相应稀释度反应平均直径大小的比值均满足1.0±0.2,方法可行.初步稳定性研究结果显示:-20℃放置24个月的候选国家参考品效价测定性能稳定.结论 候选国家参考品的纯度、蛋白质含量、水分含量及均匀性检测均符合国家参考品质量要求,将其稀释到适宜稀释度后可用于EC原液的效价测定;经方法验证与稳定性观察,显示其性能良好,为国家参考品申报提供了基础.