PCR扩增技术联合CRISPR-Cas13a系统对MTB DNA检测方法的初步研究

目的 建立一种聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)联合CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas13a识别靶基因核酸序列对结核分枝杆菌脱氧核糖核酸(Mycobacterium tuberculosis deoxyribonucleic acid,MTB DNA)进行检测的方法.方法 将MTB保守序列IS6110片段插入pMDTM 19-Tsimple Vector克隆载体,构建含待检测靶序列的模拟MTB质粒.同时针对待检测靶序列MTB保守序列IS6110设计可以检测MTB DNA的3条不同的特异性规律成簇间隔短回文重复序列RNA(CRISPR RNA,crRNA)探针(IS6110-1crRNA、IS6110-2crRNA、IS6110-3crRNA),引导CRISPR-Cas1 3a识别转录产物.将筛选出的特异性crRNA、不同待检测标本的PCR扩增转录产物、Cas13a、crRNA和Background RNA等按比例混合构建PCR-CRISPR反应体系.利用荧光定量PCR仪对含有MTB DNA不同稀释浓度的质粒模板、标准菌株H37Rv及6种非结核分枝杆菌进行检测.通过测定的相对荧光强度值分析检测的敏感度及特异度,最终建立基于MTBCRISPR-Cas13a系统的PCR-CRISPR检测方法.结果 选择相对荧光强度值最大的IS6110-1 crRNA[相对荧光强度值为197 680.64(98 364.94,304 271.25)]作为后续MTB DNA检测的crRNA探针.PCR-CRISPR检测最低拷贝数为101拷贝/μl的质粒和100拷贝/μl的H37Rv扩增产物的相对荧光强度值[分别为38 655.34(31 975.51,45 410.32)和17 691.50(17 612.36,17 793.29)]明显高于阴性对照[29 989.48(29 435.72,30 263.20)和13 725.83(13 652.43,13 804.95)](Z=-6.713、-9.448;P值均＜0.001),显示敏感度较好;阴性对照[37 635.57(37 168.74,38 199.20)]和戈登分枝杆菌[39 351.83(38 903.70,39 769.53)]、胞内分枝杆菌[39 191.30(39 018.51,39 434.95)]、堪萨斯分枝杆菌[25 172.20 (24 586.95,26 046.45)]、脓肿分枝杆菌[37 328.03 (36 959.01,37 546.78)]、鸟分枝杆菌[37 942.29(37 455.63,38 401.13)]、偶发分枝杆菌[29 491.19(29 148.63,30 058.62)]等6种非结核分枝杆菌的相对荧光强度值均明显低于106拷贝/μl的MTB DNA质粒的相对荧光强度值[89 204.07(66 253.60,108 819.13)](Z值均=-9.448,P值均＜0.001),显示特异度良好.结论 首次成功建立并验证了针对MTB的PCR-CRISPR检测技术,具有敏感度及特异度高、稳定性好、成本低等特点,有望进一步用于临床样本的检测.