MTB线粒体翻译控制28蛋白在昆虫细胞中的表达和纯化

对MTB线粒体翻译控制(mitochondrial translation control,MTC) 蛋白MTC28基因进行克隆, 构建真核表达质粒并在昆虫细胞中表达MTC28蛋白.采用PCR技术从MTB H37Rv 标准株基因组中扩增MTC28基因片断,MTC28基因片断和质粒pFastbac1经EcoRI和XhoI双酶切,T4 DNH连接酶连接,构建重组质粒pFastbac1-MTC28,转染DH5α感受态细菌,在含有氨苄青霉素溶菌肉汤(lysogeny broth,LB)固体培养基中筛选阳性克隆,挑选生长的菌落进而在含有氨苄青霉素的液体LB培养基中进行细菌克隆.PCR鉴定目的基因插入质粒后,阳性克隆细菌进行质粒(pFastbac1-MTC28)的提取.pFastbac1-MTC28质粒转染DH10 Bac感受态细菌构建重组杆状质粒(Bacmid-MTC28),用含有庆大霉素、卡那霉素和四环素的液体LB培养基进行细菌克隆,采取蓝白斑技术筛选阳性菌落.PCR鉴定为阳性的细菌进行杆状重组质粒(Bacmid-MTC28)的提取.利用脂质介导的转染技术,将杆状重组质粒(Bacmid-MTC28)转染sf9昆虫细胞中,包装重组杆状病毒,并表达蛋白质.结果成功构建了MTC28真核表达质粒,建立了杆状病毒表达MTC28蛋白的表达体系,并表达MTC28蛋白,通过纯化获得了高纯度且均一化的MTC28蛋白.