γ干扰素活化的THP-1源巨噬细胞杀伤荧光BCG的实验研究

目的 研究γ干扰素(IFN-γ)活化的THP-1源巨噬细胞对BCG的杀伤作用,并探讨其杀伤机制是否与自噬有关.方法 Phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA,也称佛波酯)诱导THP 1分化成巨噬细胞.牛分枝杆菌减毒株荧光BCG以感染复数MOI(multiplicity of infection,细菌数与细胞数的比例)10∶1感染未活化(Control组)、IFN-γ活化(IFN γ组)、Rapamycin诱导自噬(Rapa组)、3甲基腺嘌呤(3-MA)抑制自噬(IFN-γ+3-MA组)4组不同预处理的巨噬细胞.感染48 h后,超纯水裂解细胞,收集裂解液和培养上清混合,相同比例取各组混合液10μl,连续10倍稀释3次涂7H10平板培养基,置37℃生化培养箱培养,第3至4周观察记录菌落数,计算生存率[control组的菌落数为分母,其他组(包括control组)的菌落数为分子相除得到的数值为生存率].同时在感染过程的不同时间点裂解细胞提取总蛋白,以Western blot方法检测自噬标志蛋白LC3B的表达,监测细胞自噬水平的变化.实验结果数据以3次重复实验数据的“(-x)±s”形式展示(Western blot结果除外,只采用其中一个结果数据为代表).用SPSS 17.0软件进行统计分析:巨噬细胞贴壁率比较和凋亡率比较用两独立样本t检验;巨噬细胞活化后不同时间点分泌的TNF-α浓度比较和BCG感染各组巨噬细胞后的生存率比较用One-Way ANOVA检验,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 BCG感染各组巨噬细胞48 h后的生存率:Control组为(100％±0％),IFN-γ组(45％±3％),Rapa组(48％±3％),IFN-γ+ 3-MA组(91％±2％).BCG生存率经One-Way ANOVA检验,与Control组(未活化组)比较:IFN-γ组BCG生存率明显下降(P=0.01),细胞自噬水平明显增高;Rapa组BCG生存率明显下降(P=0.01),细胞自噬水平明显增高;IFN-γ+ 3-MA组BCG生存率无下降(P=0.13),细胞自噬水平无增高.结论 BCG感染巨噬细胞,或者说巨噬细胞吞噬BCG,两者的相互作用微妙而复杂.巨噬细胞在IFN-γ活化期间遭遇BCG,可以明显杀伤BCG,杀伤机制与自噬有关.