PI3 K／Akt 信号通路在染尘大鼠肺泡巨噬细胞自噬中作用

目的：观察大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383细胞在染尘处理后的自噬情况，以LY294002阻断磷脂酰肌醇3－激酶（PI3K）途径，探讨PI3K／蛋白激酶B（Akt）信号通路在其自噬中的调控作用。方法①常规培养NR8383细胞，分为空白组和染尘处理组，分别采用终浓度为0、50 mg／L的矽尘混悬液处理3、6、12、20和24 h后，收集细胞上清液，采用酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测肿瘤坏死因子－α（TNF－α）和转化生长因子－β1（TGF－β1）水平，选择最佳染尘时间。②NR8383细胞分为对照组（予等体积不含血清的F－12K培养基处理）、矽尘组（予终浓度为50 mg／L矽尘混悬液处理）和干预组（予终浓度分别为50 mg／L、20μmol／L的矽尘混悬液和PI3K 抑制剂LY294002处理），孵育后收集样品。采用ELISA法检测孵育后20 h时间点细胞上清液中TNF－α和TGF－β1水平；采用蛋白免疫印迹方法测定孵育后20 h时间点细胞中Akt和自噬标记蛋白微管相关蛋白1轻链3（ LC3）的水平；采用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）观察孵育3、6、12和20 h时间点细胞自噬免疫荧光表达情况，以及加入溶酶体抑制剂磷酸氯喹（ CDP）后细胞的自噬表达情况。结果①离体NR8383细胞染尘模型最佳处理时间为20 h。②矽尘组细胞上清液中TNF－α和TGF－β1水平均高于对照组（ P＜0．05），干预组细胞上清液中TNF－α和TGF－β1水平均高于对照组和矽尘组（ P＜0．05）。干预组细胞中Akt蛋白表达水平分别低于对照组和矽尘组；矽尘组细胞中LC3Ⅱ／Ⅰ蛋白水平分别高于对照组和干预组（ P＜0．05），干预组和对照组细胞中LC3Ⅱ／Ⅰ蛋白水平比较，差异无统计学意义（ P＞0．05）。 LSCM观察结果显示：对照组细胞3和6 h时间点自噬表达分别强于同组12和20 h时间点；矽尘组细胞12 h时间点自噬表达分别强于同组3和6 h，20 h时间点自噬表达稍弱于同组12 h，但仍强于同组3和6 h。与同时间点对照组比较，矽尘组细胞3和6 h时间点的自噬表达略减弱，但12和20 h时间点自噬表达明显增强。干预组细胞各时间点自噬表达均弱于同时间点的矽尘组，尤以20 h时间点明显。加入CDP阻断后，各组细胞的自噬表达均呈不同程度的增强。结论矽尘可诱导NR8383细胞自噬增加，PI3K抑制剂LY294002可下调自噬的表达，推测PI3K／Akt信号通路可能参与矽尘诱导肺泡巨噬细胞的自噬过程。