CHIKV Real-time PCR检测方法的建立及试剂盒研发

目的 建立快速特异检测基孔肯雅病毒的Real-time PCR方法及试剂盒.方法 根据发表在Genbank上15株基孔肯雅病毒基因序列全长,应用ClustalW2.0和DNAMAN8软件筛选出位于其E1基因上的种内保守种间特异的目的片段,并据此设计出最优引物.人工合成该基因片段并构建重组质粒,对重组质粒梯度稀释后,再利用SYBR Green Ⅰ Real-time PCR的方法检测该特异基因的浓度,建立标准品曲线,用于临床上基孔肯雅病毒的早期诊断.结果 琼脂糖凝胶电泳结果显示,标准品的PCR扩增产物的电泳条带长度与目标条带一致,测序结果显示与目标条带序列一致,说明引物与阳性质粒性能良好.经优化确定CHIKV荧光定量PCR反应体系中最佳的引物浓度为350 nmol/L,最佳的反应条件为:50℃ 2 min;95℃预变性2 min;以95℃ 15s,60℃ 15 s,72℃ 1 min进行40个循环扩增,在72℃进行荧光采集.根据荧光定量PCR熔解曲线出现特异性单峰,并对黄病毒属成员登革病毒和寨卡病毒的检测为阴性,表明该检测方法特异性高;检测阈值达302拷贝,显示敏感性好,重复试验的变异系数均小于0.1％,说明该实验设计稳定性良好.结论 基于该方法的试剂盒具有特异性好、灵敏度高、重复性好、能够快速定量等优点,有利于临床上基孔肯雅病毒的早期诊断,具有良好的应用前景.