荧光素酶标记ROP18过表达弓形虫株的构建及验证

目的 构建及验证荧光素酶标记ROP18过表达弓形虫ROP18?Ty1?LUC RH株,为研究弓形虫毒力及相关宿主免疫调控机制奠定良好基础.方法 利用PCR技术扩增出目的片段ROP18?Ty1和带ROP18?Ty1同源序列接头的质粒骨架,通过重组克隆系统构建既能表达ROP18?Ty1又含荧光素酶标记的质粒P?ROP18?Ty1?LUC.将质粒P?ROP18?Ty1?LUC和筛选质粒P?TUB?CAT?SAG1通过电转染的方法转染到RH株弓形虫,经过氯霉素筛选和极限稀释得到目的弓形虫ROP18?Ty1?LUC RH株.构建成功的弓形虫ROP18?Ty1?LUC RH株在基因、蛋白、动物水平进行验证.结果 利用重组克隆系统成功构建了质粒P?ROP18?Ty1?LUC,利用双酶切实验和测序验证了序列的正确性.以弓形虫ROP18?Ty1?LUC RH株基因组为模板,用特异引物能PCR扩增出1704 bp大小的ROP18?Ty1和1644 bp大小的LUC基因;用特异抗体anti?Ty1通过Western blot检测外源蛋白ROP18?Ty1的表达,在56000 Mr处有单一条带;用荧光素酶报告基因检测系统检测LUC的表达,利用多标记酶标仪检测到荧光的发射;通过活体成像系统检测ROP18?Ty1?LUC RH弓形虫株在小鼠体内的增殖,与对照组相比感染了ROP18?Ty1?LUC RH弓形虫株的小鼠体内photon值明显更多(P<0.05);最后小鼠毒力实验也验证了ROP18?Ty1?LUC RH弓形虫毒力比RH?LUC弓形虫的毒力强(P<0.05).结论 成功构建和验证荧光素酶标记的ROP18过表达弓形虫ROP18?Ty1?LUC RH株,可以在动物个体水平更客观统计ROP18对弓形虫增殖速率的影响.