T-2毒素对软骨细胞增殖及细胞周期的影响

目的 研究T-2毒素对大鼠软骨细胞增殖和细胞周期的影响,为T-2毒素致软骨细胞损伤的分子机制研究提供新思路.方法 提取新生Wistar大鼠的原代软骨细胞,通过甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫荧光染色进行细胞鉴定.采用细胞增殖/毒性检测试剂盒(CCK-8)检测不同剂量的T-2毒素[0(对照),1、5、10、20、50、100 μg/L]染毒24 h对软骨细胞增殖的影响,根据细胞存活率选择对照,1、5、10 μg/L(低、中、高剂量)T-2毒素用于后续实验.采用流式细胞术检测细胞周期变化;实时荧光定量PCR法和免疫印迹法分别检测T-2毒素对软骨细胞增殖细胞核抗原(PCNA)和细胞周期蛋白D1 (Cyclin D1)mRNA和蛋白表达水平的影响.结果 随T-2毒素染毒剂量增加(对照,1、5、10、20、50、100μg/L),软骨细胞存活率降低[(100.00±0.00)％、(93.12±1.66)％、(77.12±1.11)％、(59.44±4.09)％、(46.64±3.86)％、(38.15±3.37)％、(33.79±0.99)％],组间比较差异有统计学意义(F=139.21,P＜0.05).1、5、10 μg/L T-2毒素组静止期/DNA合成前期(G0/G1期)细胞[(22.03±0.42)％、(30.54±2.61)％、(36.01±1.51)％]均明显高于对照组[(13.79±1.65)％,P均＜0.05];DNA合成期(S期)细胞[(60.27±3.53)％、(53.88±4.38)％、(49.55±2.49)％]均明显低于对照组[(76.72±4.24)％,P均＜0.05].对照组,1、5、10 μg/L T-2毒素组PCNA、Cyclin D1 mRNA水平组间比较差异有统计学意义(F=46.80、17.97,P均＜0.05),其中5、10 μg/L T-2毒素组(0.77±0.13、0.79±0.08,0.60±0.07、0.56±0.05)均明显低于对照组(0.99±0.02、1.01±0.01,P均＜0.05).5、10 μg/L T-2毒素组PCNA蛋白水平(0.69±0.03、0.49±0.03)均低于对照组(0.92±0.05,P均＜0.05);1、5、10μg/L T-2毒素组Cyclin D1蛋白水平(0.80±0.06、0.60±0.07、0.33±0.13)均低于对照组(0.95±0.07,P均＜0.05).结论 T-2毒素可以抑制软骨细胞增殖,其机制可能是通过影响细胞周期蛋白表达,引起细胞周期阻滞,从而抑制DNA合成.