氟化钠对人成骨细胞CyclinD1基因启动子区甲基化及其转录表达的影响

目的 构建人原代成骨细胞氟中毒模型,检测不同剂量氟化钠对人成骨细胞中CyclinD1基因启动子区甲基化、mRNA转录及蛋白表达的影响,从细胞周期调控基因的表观遗传学角度探索氟中毒发生机制.方法 在知情同意原则下,收集贵州航空工业集团贵阳医院骨科外伤手术健康人(车祸)髂骨或股骨松质骨.采用酶消化法分离人原代成骨细胞,以碱性磷酸酶及钙化结节染色进行细胞鉴定;以0、125、250、500及1 000 μmol/L氟化钠处理细胞72 h.以硫化测序PCR法(bisulfite sequencing PCR,BSP)检测CyclinD1基因启动子区甲基化状态;以实时荧光定量PCR(QT-PCR)检测CyclinD1基因转录mRNA相对表达量;以免疫印迹法(Western-blotting)检测CyclinD1蛋白表达.结果 分别以0、125、250、500及1 000 μmol/L氟化钠处理细胞72 h后,CyclinD1基因启动子区未检测到甲基化;CyclinD1基因mRNA转录相对表达量在0、125、250、500及1 000 μmol/L NaF剂量组分别为0.414±0.093、0.742 ±0.089、0.796 ±0.122、1.114 ±0.260、1.140±0.171,NaF剂量组均高于对照组(F=18.89,P＜0.05).CyclinD1蛋白相对表达量分别为0.304±0.014、0.395±0.020、0.511 ±0.042、0.565±0.028、0.719±0.047,NaF剂量组均高于对照组(F=71.80,P＜0.05).CyclinD1基因转录mRNA及其蛋白表达随氟化钠剂量的升高均相应上升(P＜0.05).结论 氟化钠上调人成骨细胞中CyclinD1基因转录与表达,是氟致人成骨细胞增殖能力及细胞周期时相分布发生改变的重要分子机制之一,但未观察到CyclinD1基因启动子区甲基化参与其表达上调过程.