独活寄生汤含药血清抑制白细胞介素1β诱导的软骨细胞炎症反应的作用机制研究

目的:探讨独活寄生汤含药血清抑制白细胞介素1β(interleukin-1 beta,IL-1β)诱导的软骨细胞炎症反应的作用机制.方法:将10只2月龄雄性SD大鼠随机分为正常组和独活寄生汤组,独活寄生汤组以9.3 g· kg-1剂量的独活寄生汤灌胃,正常组给予等量生理盐水灌胃;每日灌胃2次,连续1周;末次灌胃后,经腹主动脉取血,分别制备独活寄生汤含药血清及空白血清,低温保存备用.截取6只4周龄SD大鼠膝关节软骨,采用酶消化法分离并培养软骨细胞,光学显微镜下观察软骨细胞形态,并用Ⅱ型胶原酶免疫组化鉴定.取生长良好的第2代软骨细胞,采用MTT法检测含药血清培养24 h、36 h、48 h、72 h后的软骨细胞活性,采用酶联免疫吸附法测定不同浓度IL-1β干预后软骨细胞的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-13含量.将培养好的第2代软骨细胞随机分为空白血清组、模型组、独活寄生汤含药血清组,其中空白血清组以含10％空白血清的培养基(dulbecco modified eagle medium,DMEM)培养;模型组加入浓度为15 ng· mL-1的IL-1β干预24 h后,采用含10％空白血清的DMEM培养;独活寄生汤含药血清组加入浓度为15 ng· mL-1的IL-1β干预24 h后,采用含10％独活寄生汤含药血清的DMEM培养;3组均连续培养48 h,采用Western blot法检测软骨细胞中G蛋白偶联信号传导系统关键调控因子的蛋白表达情况.结果:①软骨细胞形态及免疫组化鉴定结果.第2代软骨细胞胞浆丰富,细胞周围可见具有折光性的细胞外基质,细胞长势呈“铺路石”状,胞浆呈棕黄色阳性染色.②独活寄生汤含药血清培养不同时间后的软骨细胞活性.含药血清培养24 h、36 h、48 h、72 h后的软骨细胞活性比较,差异有统计学意义(1.01±0.01,1.03±0.02,1.07 ±0.01,1.02±0.02,F=8.300,P=0.008).含药血清培养24 h时的软骨细胞活性低于培养48 h时的软骨细胞活性(t=-4.648,P=0.002);与培养36 h、72 h时的软骨细胞活性比较,差异无统计学意义(t=-1.549,P=0.160;t=-0.775,P=0.461).③不同浓度IL-1β干预后的MMP-13含量.在含IL-1β浓度为0ng· mL-1、5 ng· mL-1、10 ng·mL-1、15 ng·mL-1、20 ng · mL-1、25 ng· mL-1的DMEM中培养24 h后软骨细胞MMP-13含量比较,差异有统计学意义[(0.07 ±0.01)ng·mL-1,(0.08±0.01)ng· mL-1,(0.09±0.01)ng·mL-1,(0.10±0.01)ng· mL-1,(0.08±0.01)ng· mL-1,(0.06±0·01)ng·mL-1,F=6.823,P=0.001].未经IL-1β干预时的软骨细胞MMP-13含量与浓度为5 ng·mL-1、20 ng·mL-1、25ng·mL-1的IL-1β干预后软骨细胞MMP-13含量比较,差异均无统计学意义(LSD-t=-2.049,P=0.055;LSD-t=-2.083,P=0.052;LSD-t=0.496,P=0.626);浓度为10 ng·mL-1、15 ng·mL-1的IL-1β干预后软骨细胞MMP-13含量高于未经IL-1β干预时的软骨细胞MMP-13含量(LSD-t=-3.412,P=0.003;LSD-t=-4.216,P=0.001);浓度为10 ng·mL-1的IL-1β干预后软骨细胞MMP-13含量与浓度为15 ng·mL-1的IL-1β干预后软骨细胞MMP-13含量比较,差异无统计学意义(LSD-t=-0.804,P=0.432).④软骨细胞中G蛋白偶联信号传导系统关键调控因子的蛋白表达.空白血清组、模型组和独活寄生汤含药血清组的Gαs、Gαq、Gαo和Gαi蛋白表达量比较,组间差异均有统计学意义[(0.81±0.09) kDa,(0.31±0.07) kDa,(0.78±0.13)kDa,F=23.669,P =0.001;(0.22±0.04) kDa,(0.14±0.02) kDa,(0.20±0.02) kDa,F=6.500,P =0.031;(0.25±0.02) kDa,(0.12±0.01) kDa,(0.18±0.03) kDa,F =27.214,P =0.001;(0.21 ±0.02) kDa,(0.26±0.02) kDa,(0.19-±0.03) kDa,F=6.882,P=0.028];空白血清组Gαs、Gαq、Gαo蛋白表达量高于模型组(LSD-t=6.134,P=0.001;LSD-t=7.370,P=0.000;LSD-t=3.465,P=0.013),Gαi蛋白表达量低于模型组(LSD-t=2.572,P=0.042);模型组Gαs、Gαq、Gαo蛋白表达量低于独活寄生汤含药血清组(LSD-t=5.766,P=0.001;LSD-t=3.401,P=0.014;LSD-t =2.599,P =0.041),Gαi蛋白表达量高于独活寄生汤含药血清组(LSD-t=3.609,P=0.011).结论:独活寄生汤含药血清可以抑制IL-1β诱导的软骨细胞炎症反应,其作用机制可能与G蛋白偶联信号传导系统的调控有关,但其具体作用靶点有待进一步深入研究.