过表达及定点突变缝隙连接蛋白Cx43小鼠黑色素瘤细胞模型的构建

目的：构建小鼠黑色素瘤细胞（B16）过表达野生型及点突变型缝隙连接蛋白43（Connexin43， Cx43）细胞模型，为以缝隙连接（Gap Junction， GJ）为靶点的中药复方、中药单药及药物单体的研究提供可靠阳性对照和阴性对照。方法构建野生型Cx43、突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R重组荧光蛋白融合慢病毒表达质粒，用定点突变技术获得Cx43G21R和Cx43G138R突变体，对上述3种质粒进行双酶切和测序鉴定，并分别包装病毒感染B16细胞，使B16细胞过表达野生型Cx43、突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R。 Western blot检测Cx43蛋白表达水平变化，荧光示踪法观察缝隙连接通讯（Gap Junction Intercellular Communication， GJIC）功能变化。结果①酶切及测序证明，成功构建 pLVCx43-mCherry、 pLVCx43-mCherryG21R、 pLVCx43-mCherryG138R重组荧光蛋白融合慢病毒表达质粒。②成功感染B16细胞并筛选稳定过表达Cx43、 Cx43G21R、Cx43G138R细胞株， Western blot检测显示上述细胞株Cx43蛋白表达均高于对照组。③过表达野生型Cx43后B16细胞GJIC功能较对照组增强；过表达突变型Cx43后B16细胞GJIC功能较对照组减弱。结论过表达野生型Cx43可增强B16细胞GJIC功能，过表达突变型Cx43可抑制B16细胞GJIC功能。