参环毛蚓体内核苷磷酸化酶的活性测定及动力学分析

目的：建立参环毛蚓体内嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）的检测方法，以肌苷为底物，评价该酶的活性。方法采用 HPLC 法，色谱条件：Ecosil C18-AQ 柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流动相为10 mmol·L-1磷酸二氢铵缓冲液（pH4.5）和甲醇，梯度洗脱，流速为0.8 mL·min-1，柱温为室温，检测波长254 nm，用底物肌苷与组织粗蛋白提取液在室温孵育30 min，沸水煮5 min 终止反应，12000 r·min-1离心10 min，取上清过滤后进行 HPLC 分析，以 OriginPro 8.5软件作图，计算酶动力学参数。结果酶反应中产物次黄嘌呤在0.5～40μmol·L-1范围内呈良好的线性关系（r=0.9996）；精密度小于3.5%，回收率大于80%。PNP 酶动力学参数：Vmax 为0.015nmol·min-1·mg-1， Km 为19.8μmol·L-1。结论成功构建了参环毛蚓体内次黄嘌呤代谢酶活性测定相关的实验体系，该法所得数据稳定可靠，可准确反映关键酶活性的动态变化。