广州管圆线虫蛋白酶体α5基因的克隆、表达及重组蛋白对人THP-1巨噬细胞凋亡的影响

目的 获得广州管圆线虫蛋白酶体α5基因(pas-5),构建其重组质粒,探讨PAS-5重组蛋白对人THP-1巨噬细胞凋亡的影响. 方法 以广州管圆线虫逆转录DNA为模板,PCR扩增pas-5基因,构建pcoldⅢ-pas-5重组质粒,转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞,取菌液进行PCR、双酶切和测序鉴定.阳性质粒经0.1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白表达情况,采用镍离子亲和层析法纯化重组蛋白.将用佛波酯诱导的人THP-1巨噬细胞经PAS-5(实验组)孵育18h后,采用流式细胞术观察细胞凋亡情况,采用ELISA检测细胞培养上清中细胞因子白细胞介素-10(IL-10)水平,另设阴性对照组(牛血清白蛋白)和空白对照组(RPMI 1640).结果 Pas-5基因PCR扩增产物约为800 bp,与预期大小相符.经菌液PCR、双酶切和测序鉴定获得pcoldⅢ-pas-5重组质粒.SDS-PAGE分析结果显示,PAS-5重组蛋白主要以包涵体形式存在,其相对分子质量约28 000.Western blotting分析结果显示,重组蛋白能与兔抗鼠His单克隆抗体特异性结合.镍离子亲和层析纯化重组蛋白后获得单一条带.流式细胞术分析结果显示,阴性对照组和实验组人THP-1巨噬细胞凋亡率分别为(0.380±0.194)％和(0.052±0.036)％,两者差异有统计学意义(P＜0.05).ELISA检测结果显示,实验组细胞培养上清中IL-10水平为(77.606±1.766) pg/ml,高于阴性对照组的(45.652±5.975) pg/ml (P＜0.05). 结论 获得了pas-5基因和重组质粒pcoldⅢ-pas-5,重组蛋白PAS-5可抑制人THP-1巨噬细胞凋亡,与IL-10水平提高有一定关系.