利用sgRNA串联表达框架编辑恶性疟原虫K13和NUP116基因的研究

目的 利用单链引导RNA (sgRNA)串联表达框架编辑恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)K13和NUP116基因.方法 根据恶性疟原虫K13和NUP116基因序列设计引物,PCR扩增K13和NUP116基因的同源臂,并引入突变位点.PCR串联基因K13和NUP116的sgRNA,将同源臂和串联的sgRNA与载体pL6cs连接,构建用于电击转染实验的载体pL6-K13-NUP116,将其与表达Cas9蛋白的质粒一同通过电击转染法,转入恶性疟原虫体内,利用成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9 (CRISPR/Cas9)系统对基因进行编辑修饰,通过筛选药物二氢叶酸还原酶抑制剂(WR)和杀稻瘟菌素(BSD)筛选转基因疟原虫,提取转基因疟原虫的基因组,对其进行PCR检测,最终通过测序鉴定K13和NUP116基因是否成功被突变修饰.结果 PCR扩增出K13和NUP116串联的同源臂(K13全长557 bp,NUP116全长569 bp)以及串联的sgRNA,与载体pL6cs连接后成功获得用于电击转染实验的表达载体pL6-K13-NUP116.电击转染后通过药物筛选转基因疟原虫,培养至第28天涂片镜检发现疟原虫.PCR检测结果显示,转基因疟原虫K13和NUP116基因突变修饰成功.测序表明,K13和NUP116基因的目标位点被成功突变.结论 基于CRISPR/Cas9编辑技术的串联sgRNA表达载体可同时对恶性疟原虫K13和NUP116基因进行编辑.