抗结核分枝杆菌DNA疫苗的构建及免疫原性研究

目的:构建抗结核分枝杆菌(TB) DNA疫苗并进行体内外的鉴定.方法:采用PCR技术分别扩增TB(H37Rv)抗原单基因Ag85a、Ag85b以及融合基因Ag85a-Esat6和Ag85b-Esat6融合基因,其5’端均含人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号肽,将目的基因分别亚克隆于pVAX1真核表达载体,得到Ag85a/pVAX1、Ag85b/pVAX1、Ag85a-Esat6/pVAX1和Ag85 b-Esat6/pVAX1四种质粒;经酶切和测序鉴定正确后,质粒转染COS-7细胞48 h,取上清液检测目的蛋白表达情况;利用在体电脉冲技术(EP)将质粒注射BALB/c小鼠双侧胫前肌,检测特异性的体液和细胞免疫应答.结果:四种质粒基因片段方向、序列正确;Western blot检测COS-7细胞转染48 h后的上清,均有清晰特异性的目的蛋白条带,并定量检测到Esat6蛋白的表达水平可达10 ng/ml;小鼠免疫实验结果表明,仅质粒Ag85b/pVAX1和Ag85 a-Esat6/pVAX1可诱导针对结核抗原分泌高水平IFN-γ的Th1型免疫应答和特异性杀伤应答,其中通过ELISA检测小鼠血清的lgG和ELISPOT检测脾细胞分泌IFN-γ的实验结果阳性率均为100％,且Ag85 a-Esat6/pVAX1的效果较好些,与卡介苗具有显著性差异.结论:成功构建了抗TB的DNA疫苗,其中Ag85 a-Esat6/pVAX1质粒DNA疫苗的免疫效果较好,为进一步研发治疗性的TBDNA疫苗奠定基础.