LMP-1单链抗体基因修饰人外周血单个核细胞的构建及鉴定

目的:构建携带抗-1型潜伏膜蛋白(anti-LMP-1)的单链抗体序列的过表达载体并包装慢病毒,构建及鉴定LMP-1单链抗体基因修饰的人外周血单个核细胞(PBMCs).方法:根据GenBank中LMP-1单链抗体、CD28及CD3ζ序列设计引物并合成,从已有pVitro-IgG-1载体钓取IgG-1-Fc段,并分别插入慢病毒表达载体,获得pCDH-anti-LMP-1-IgG-Fc-CD28-CD3ζ(CAR)及pCDH-CD28-CD3ζ(对照VEC)并测序鉴定,测序成功后采用三质粒包装系统(核心质粒pCDH、包装质粒pSPAX2和pMD2.G)分别包装慢病毒CAR及VEC;浓缩慢病毒并离心感染PBMCs,经荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,并利用流式细胞术检测GFP+比率以鉴定目的蛋白的表达.结果:构建了过表达LMP-1单链抗体基因的质粒并成功包装慢病毒,浓缩慢病毒感染PBMCs后GFP+细胞数可达42.5％ (VEC-PBMCs)及51.0％ (CAR-PBMCs).结论:为进一步研究anti-LMP-1修饰的PBMCs对LMP-1阳性肿瘤细胞的靶向杀伤奠定了实验基础.