使用透明质酸钠复合海藻酸钠水凝胶球3D培养软骨细胞抑制细胞去分化的研究

目的:验证海藻酸钠(Alginate,Alg)水凝胶球添加透明质酸钠(Sodium hyaluronate,HA)后,对大鼠膝软骨细胞体外3D培养时软骨细胞去分化的抑制情况.方法:用Ⅱ型胶原酶消化法获取2周龄SD大鼠膝关节原代软骨细胞,体外培养传代至P2.细胞分为2组,l组用2％海藻酸钠水凝胶球3D培养(Alg组),另一组用2％海藻酸钠+1％透明质酸钠的水凝胶球3D培养(Alg/HA组),采用正交法制作海藻酸钠水凝胶球.培养14天后,两组各取水凝胶球进行死活细胞染色观察细胞状态.其他水凝胶球收集后用4％多聚甲醛固定,30％蔗糖溶液脱水,OCT (Optimal cutting temperature compound)包埋剂包埋切片,采用苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE染色)、甲苯胺蓝染色观察软骨细胞形态;采用阿利新蓝染色观察对比糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)含量;采用免疫荧光染色对比Ⅱ型胶原(Collagen type Ⅱ,Col Ⅱ)含量;采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测软骨细胞Col Ⅱ和聚蛋白多糖(Aggrecan,ACAN)的表达情况.结果:死活细胞染色显示两组水凝球内软骨细胞状态良好,几乎无死细胞;阿利新蓝染色显示Alg/HA组与Alg组相比软骨细胞分泌更多的GAG;免疫荧光染色显示Alg/HA组比Alg组软骨细胞内含更多的Ⅱ型胶原;Western blot显示Alg/HA组软骨细胞比Alg组Col Ⅱ的蛋白表达更多.结论:含透明质酸钠的海藻酸钠水凝胶可以更好地维持软骨细胞的表型,抑制软骨细胞去分化.